說起三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)大家都不陌生，它是砒霜中的主要成分，早在李時珍所著的《本草綱目》中便有記載：砒霜主治中風痰壅，瘧疾以及項上瘰疬。

砒霜不僅僅在中國古代有使用，在近代西方國家中也有使用。比較有名的記載是十八世紀二十年代英國人托馬斯·弗勒發(fā)明的弗勒溶液，其后來也被收入到英國藥典和美國藥典中。

但是砷具有強烈的毒性，1903年英國制造啤酒過程中由于原料砷污染，導致6000人中毒70人死亡，1928年法國有4萬人由于面包和酒砷污染而中毒，1955年日本森永奶粉公司的配方生產過程中砷污染導致12131名新生兒中毒，130人死亡，等等。這一系列砷中毒事件使得砷劑的研究一度陷入低潮，直到2001年陳竺教授發(fā)表的文章——Arsenic trioxide, a therapeutic agent for APL. 才將砒霜從谷底撈出。

然而，三氧化二砷ATO治療白血病的療效在實體瘤中卻不能復制，經研究發(fā)現主要原因是實體瘤細胞自噬水平較高，其與凋亡形成拮抗，阻礙實體瘤進入程序性死亡。那么是否可以通過抑制實體瘤自噬，使得ATO促凋亡作中占主導，最終使天平向凋亡傾斜？

2018年10月9日發(fā)表在Nature Communications上，IF：11.978，通訊作者：樊春海，單位：上海交通大學化學化工學院

1.納米金剛石是一種十分強效的自噬抑制劑

多種納米粒子表現出不同的細胞自噬抑制作用，為了找到一個安全有效的納米粒子抑制劑，作者選用HepG2細胞檢測了納米金(AuNPs)、納米三氧化二鐵和四氧化三鐵、納米金剛石(NDs)等各種納米粒子的自噬抑制作用。結果發(fā)現NDs、AuNPs和納米四氧化三鐵增加LC3-Ⅱ的積累，以及自噬底物p62（圖1a）。為了進一步評估這些納米粒子的自噬抑制作用，作者用shRNA靶向作用于ATG5，ATG7。ATG5/7缺失減少了NP誘導的LC3轉化。免疫熒光結果也顯示傳統(tǒng)自噬抑制劑——氯喹CQ處理后導致黃色標記的LC3斑點增多。而NDs組紅色標記的LC3斑點（mCherry陽性，GFP熒光陰性的自溶酶體）增加，這表明干擾了溶酶體清除（圖1b）。因此，NDs與CQ有著不同的自噬抑制機制。CQ+NDs與NDs相比，LC3-Ⅱ增加，并且p62積累也增加，這進一步證實了NDs起到自噬抑制作用，以調節(jié)自噬通量和自體溶酶體通量（圖1c）。綜上，證實了NDs在細胞中的自噬抑制作用。并且進一步揭示NDs與CQ有著不同的自噬抑制機制，二者聯合應用可以提高自噬抑制作用。作者接下來探索NPS是否能夠影響ATO介導的HepG2凋亡。NDs和AuNPS增加了ATO介導的細胞凋亡，另外，ATG5/7缺失減少了NDs介導的ATO誘導的細胞凋亡（圖1d）。在確定了NDs的自噬抑制作用后，作者進一步探究其在自體吞噬體加工過程中的機制作用。結果發(fā)現NDs處理導致NUPR1水平呈時間依賴性降低（圖1e）。另外，ATG5/7缺失顯著性地減輕了NDs引起的NUPR1耗竭。綜上，證明了NDs通過損害細胞中NUPR1介導的自溶酶體滲透而起到自噬抑制劑的作用。

圖1

2.ATO處理的HepG2自噬抑制的機制分析

作者接下來研究自噬抑制在ATO處理的HepG2細胞凋亡增強中的分子機制。

CQ+ATO聯合處理HepG2可以增強細胞毒性，相反，NB4（急性早幼粒細胞白血病細胞系，自噬水平低）與CQ和ATO聯合應用處理并沒顯示出明顯的細胞凋亡，這樣表明自噬在ATO處理的APL細胞中不起作用（圖2a、b）。

在證實了自噬抑制在HepG2中基于ATO的細胞毒性中起到重要作用后，作者進一步探索NDs如何影響ATO治療的HepG2。與CQ相似，當NDs添加到ATO處理的HepG2細胞中后，WB結果顯示LC-Ⅱ累計的增加以及p62降解的抑制（圖2c）。共聚焦結果進一步證明NDs的共處理顯著減少由ATO誘導的LC3小點的形成，同時增加了細胞中的LC3陽性點裝結構的積累。（圖2e）TEM成像結果顯示共處理可以顯著性減少ATO誘導的自噬體形成，并且誘導含有NDs的自溶體的積累。（圖2e）另外，共處理好觀察到細胞內存在許多液泡，并伴隨著caspase-3活性的增加（圖2e）。

圖2

3.NDs作為自噬抑制劑可以提高基于ATO的體內治療療效

為了評估NDs在基于ATO治療中療效，作者進行了一系列的體內外實驗，從而評估NDs/ATO組合的治療的安全性。NDs組相比于CQ組，血液中的各項指標較為穩(wěn)定，且基本處于正常范圍內（圖3a）。在原位瘤模型中，NDs/ATO的血液循環(huán)曲線幾乎每天保持恒定，并且每次給藥后1/24h內從血液中清除（圖3b）。此外，作者也檢測它們的體內生物分布和清除率，在給藥48小時后，NDs熒光信號顯示NDs主要分布在腫瘤體，肝臟和腎臟中（圖3c）。定量分析結果也顯示NDs在脾和肺中累積，而ATO主要分布在腫瘤體，心臟，肝，脾，肺和腎（圖3d）。絕大多數的NDs的累積在72小時后被清除了，而這個時間點又正好是下一次給藥的時間點（圖3d）。在證明NDs/ATO聯合治療療法的突出生物相容性和腫瘤靶向性，作者進一步探討NDs自噬抑制劑是否可以改善體內基于ATO的療法。與NS組相比，首次給藥后第91天，NDs/ATO組合將腫瘤重量降低至～33%，而單獨使用NDs或者ATO（0.75mgkg-1）的治療并沒有顯著影響腫瘤重量。對于1.5mgkg-1ATO組別，添加NDs可以將腫瘤重量從67%降低至9%，表明具有協同抗腫瘤作用（圖4a，b）。另外，NDs/ATO組合可以降低肝臟腫瘤相關癥狀，如黃疸，肝腹水，以及肝硬化（圖5a）。作者接下來探討了治療小鼠的存活率和健康狀況。在NDs與高劑量ATO共同治療的組中，小鼠存活150天以上。而與陰性對照組相比，單獨使用不同劑量的ATO治療只能提供有限的生存天數（圖4e）。陰性對照組或ATO治療組中的所有小鼠都死于疾病，實現長期生存的比例低于30%。此外，組織學分析，體重曲線和主要器官的系數表明，聯合治療方案沒有明確的副作用（圖4f，5b）。

圖3

4.NDs+ATO短期和長期治療的研究

為了進一步比較NDs+ATO與ATO治療的短期與長期內腫瘤重量，肝損傷相關血清生化指標，作者選擇給藥后35天和91天作為短期與長期的天數。結果表明NDs+ATO聯合治療組的腫瘤比重隨時間降低，而ATO治療組腫瘤的重量比隨時間沒有明顯變化（圖5c）。

更有趣的是，NDs-ATO聯合治療組中的所有生化參數在35天時或多或少增加，最終恢復到正常小鼠91天時觀察到的范圍。相比之下，ATO治療組中的這些參數隨時間顯著增加（圖5d）。此外，NDs+ATO比CQ+ATO具有更高的治療效果。首次給藥后第91天進行腫瘤重量比分析，發(fā)現NDs+ATO可將腫瘤重量減少約91%，而CQ+ATO僅為～58%（圖4b）。CQ之所以療效較低原因可能是腫瘤微環(huán)境pH值較低，阻礙CQ發(fā)揮抑制自噬作用。

圖4

5.NDs API增強肝癌ATO治療的分子機制的探索

作者認為，NDs+ATO聯合治療的安全性和有效性來源于對器官的自噬特異性抑制。將荷瘤小鼠進行了LC2Ⅱ和ATG13進行免疫染色，結果發(fā)現，接受治療的小鼠顯示出明顯的LC3Ⅱ和ATG13斑點，尤其是在腫瘤內部和周圍血管的周圍（圖4g）。因此，作者確證了NDs+ATO聯合治療后腫瘤中自噬通量的調節(jié)。WB和TEM結果均證實NDs有抑制肝癌細胞組織中ATO誘導的自噬（圖4c，6a）。TEM分析腫瘤結果也表明NDs在腫瘤部位的累積是由于增強的滲透性和保留效果（圖6a）。

圖6

總結

砒霜，我國的一味傳統(tǒng)的中藥，具有良好的治療白血病的功效，但是對于實體瘤的治療卻一直沒有很好的效果。這篇文章通過對比APL與HepG2細胞之間的差異——自噬水平不同，從而提出科學家說——能否通過抑制實體瘤細胞自噬從而提高ATO對實體瘤發(fā)揮促凋亡作用？并且作者通過一系列的實驗證明了這個科學假說，擴大了ATO臨床上抗腫瘤的范圍，具有較高的臨床價值。但是，這其中的分子機理還可以做進一步探索。