亨廷頓?。℉D）是一種遺傳性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為運動異常、精神癥狀和認(rèn)知能力下降。機理研究顯示，HD是由4號染色體上的一個突變引起的，當(dāng)CAG重復(fù)序列超過35-40時，有毒的亨廷頓蛋白聚集。自由基的產(chǎn)生在HD的進展中起著關(guān)鍵作用，盡管目前仍不確定它們是其他病理事件的病因還是結(jié)果。

       目前，用于測量自由基生成的方法包括：間接方法和分子影像學(xué)技術(shù)。間接方法測量自由基或特定分子對自由基產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物。分子影像學(xué)技術(shù)包括用顯微鏡工具進行光學(xué)標(biāo)記，或用磁共振技術(shù)進行磁共振標(biāo)記，如磁共振成像（MRI）或電子自旋共振（ESR）。然而，這些方法通常測量反應(yīng)產(chǎn)物的累積歷史，而非當(dāng)前狀態(tài)。由于反應(yīng)分子在這段時間內(nèi)可以自由擴散，因此空間分辨率有限。此外，這些分子可以與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而影響自由基的濃度，而且它們往往具有一定程度的固有毒性。許多探針表現(xiàn)出與其他活性分子或特定酶的交叉反應(yīng)性。

       基于金剛石NV（氮空位）中心的量子傳感提供了一個有吸引力的替代方案。這些NV中心釋放出前所未有的穩(wěn)定紅色熒光，其強度會根據(jù)自旋狀態(tài)而變化。因此，人們可以使用這種熒光來測量磁場或磁噪聲。最近，這種技術(shù)已被用于測量活細(xì)胞中自由基的生成。如：測量癌細(xì)胞、細(xì)菌、免疫細(xì)胞、酵母細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，或作為細(xì)胞對病毒的反應(yīng)。在本次分享的文章“In Vivo Nanodiamond Quantum Sensing of Free Radicals in Caenorhabditis elegans Models”中，作者同樣利用量子傳感揭示線蟲細(xì)胞中polyQ位置的應(yīng)激反應(yīng)（圖1）。在HD模型中，研究人員選取了AM141 Q40::YFP、OW450 Q0::YFP（陰性對照）、GA480（缺乏雙超氧化物歧化酶基因sod-2和sod-3，作為氧化應(yīng)激的陽性對照）線蟲株來評估氧化應(yīng)激的水平。

圖1  a.基于金剛石的量子傳感示意圖

b-c. 不同線蟲株在量子傳感實驗中呈現(xiàn)不同的熒光強度  d-e.用于量子傳感實驗的裝置圖

       FNDs的吸收和分布

       為防止FNDs（fluorescent nanodiamonds）的積累并促進線蟲對顆粒的吸收，研究人員將牛血清白蛋白（BSA）包裹在FNDs上，并將FND/BSA通過口服給藥飼喂給線蟲，觀察adult Day1的N2和GA480蟲株，在其消化系統(tǒng)的管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)清晰可見FNDs的熒光。而且在鄰近細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了一些FNDs，說明FND/BSA可以穿過腸道細(xì)胞并擴散到其他部位（圖2）。

圖2  FND/BSA的吸收分布情況

       進一步采用等劑量孵育方案處理OW450 Q0::YFP和AM141 Q40::YFP線蟲，發(fā)現(xiàn)FND/BSA在體內(nèi)呈現(xiàn)差異化分布，在消化腔內(nèi)之外，一些顆粒擴散到體壁肌區(qū)，與擴散的YFP產(chǎn)生共定位（圖3b）或停留在polyQ聚集物附近（圖3c）。

圖3  FND/BSA在HD模型線蟲中的分布情況

       采用T1弛豫法檢測自由基

       T1弛豫測量法依賴于感知FND周圍的磁噪聲，實現(xiàn)了活體線蟲體壁肌肉組織中PolyQ蛋白聚集體附近自由基的原位檢測。這里值得一提的是，實驗過程中線蟲本體與納米金剛石均存在0-1μm的位移。如果納米金剛石與polyQ聚集物在相同的位置（例如，它們在同一個囊泡中，或者隨線蟲整體運動），那么二者的相對位置保持恒定。自由基也可以在細(xì)胞中擴散，但它們的擴散范圍受到其壽命的限制，僅在數(shù)十納米范圍內(nèi)才能被納米金剛石有效檢測。在一次測量中，研究人員選擇了一個光子數(shù)約為107的納米金剛石。線蟲自發(fā)熒光光子數(shù)低于106，因此很容易將自發(fā)熒光與 FND 區(qū)分開來。首先選擇一個位于線蟲體內(nèi)期望位置的FND（圖4a），隨后在激光脈沖過程中進行動態(tài)追蹤（圖4a1，a2），并進行雙指數(shù)衰減分析。實驗中采用650nm濾波器去除YFP干擾信號。關(guān)鍵參數(shù)T1值由雙指數(shù)曲線的衰減速度來量化，反映了周圍環(huán)境中的磁噪聲。T1值越低，表示自由基濃度越高。

圖4a Q40線蟲中FND/BSA的熒光圖像。

白色的虛線是身體的邊界。底部顯示的強度條表示光子數(shù)/s

       如圖1b所示，在體壁肌肉附近的單次FND測量中，sod-2/3突變線蟲的T1值低于N2，驗證了該技術(shù)在活體模型中的可靠性，并揭示T1降低與自由基濃度升高的劑量效應(yīng)關(guān)系。研究進一步對OW450、AM141株系進行測量，發(fā)現(xiàn)AM141體內(nèi)的FND產(chǎn)生更快的衰變。從單次FND測量中可以觀察到Q0和Q40之間的差異，表明T1弛豫測量法具有高靈敏度。

       在擴大樣本量的驗證實驗中，研究團隊對N2和sod突變線蟲進行組間比較，每組選擇30多只線蟲進行重復(fù)測量。結(jié)果顯示兩株線蟲肌肉、腸道的T1值均具有顯著性差異（p≤0.0001），提示sod突變體全身存在應(yīng)激脅迫。然而，在N2和Q0線蟲之間的比較顯示，兩者僅在肌肉上有顯著差異（圖4b），而在腸道中沒有顯著差異（圖4c）。由于Q0::YFP主要在身體肌肉中表達，這一結(jié)果證明外源YFP蛋白的表達本身即可誘發(fā)局部氧化應(yīng)激。

       Q40與Q0線蟲身體肌肉相比（圖4b），Q40的T1值出現(xiàn)了顯著的下降（p≤0.01），提示Q40中自由基水平的升高。另外，實驗發(fā)現(xiàn)Q0的數(shù)據(jù)比Q40的數(shù)據(jù)分布更大，這種差異可能歸因于T1的非線性濃度依賴性，在較低的自由基濃度下T1的變化更為敏感。在腸道中（圖4c），在Q0和Q40線蟲之間也觀察到顯著的差異，這可能是由于Q40線蟲中各種應(yīng)激反應(yīng)（包括skn-1介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)、daf-16介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和缺氧反應(yīng)）被激活，從而誘發(fā)腸道應(yīng)激脅迫。

圖4b-c 不同線蟲株的肌肉和腸道T1值差異性比較

       T1校準(zhǔn)曲線顯示，Q0和Q40線蟲之間不同組織的自由基濃度變化是不同的。在腸道中，磁信號濃度從Q0的≈0.3nM增加到Q40的≈10.4nM。然而，在身體肌肉中，增加的幅度要大得多，從Q0的2.9nM到Q40的9100nM，表明肌肉中PolyQ產(chǎn)生的自由基明顯多于腸道的自由基。針對線蟲不同部位進行T1測量，發(fā)現(xiàn)：在AM141 Q40::YFP成蟲中，Q40主要積累在體壁肌細(xì)胞中，與腸道相比，其自由基水平顯著增加。同樣地，OW450 Q0::YFP的體壁肌肉自由基水平明顯高于腸道，進一步說明YFP的表達直接促進了自由基的生成（圖4d-e）。

圖4d-e 線蟲不同組織間的T1差異性比較

       小編總結(jié)

       本研究證明了使用T1弛豫測量法檢測生物體中自由基水平的可行性，特別是在線蟲HD模型中。研究人員觀察到，在表達polyQ線蟲中，T1值顯著降低，表明氧化應(yīng)激水平升高。此外，通過在不同的身體部位進行T1測量，能夠區(qū)分polyQ聚集物和外源性YFP蛋白對自由基生成的貢獻。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了T1弛豫測量法作為研究疾病模型中氧化應(yīng)激動力學(xué)的敏感工具的潛力。此外，該研究強調(diào)了量子傳感技術(shù)的實用性，如T1弛豫測量法，在體內(nèi)納米水平上探索生物過程，為進一步了解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制和靶向治療策略的發(fā)展提供了新的道路。

       參考文獻：Fan S, Zhang Y, Ainslie AP, et al. In Vivo Nanodiamond Quantum Sensing of Free Radicals in Caenorhabditis elegans Models. Adv Sci (Weinh). DOI：10.1002/advs.202412300