納米粒子nanoparticles(NPs)具有出色的物理化學(xué)特性，在生物醫(yī)學(xué)中被廣泛用于成像，診斷和治療。但隨著研究的深入，人們研究發(fā)現(xiàn)，NPs存在著許多生物特性，在進(jìn)入生物體后可以與多種內(nèi)源蛋白相互作用，從而發(fā)揮生物活性，如前文書(shū)中的NDs可以抑制實(shí)體瘤的自噬從而提高ATO抗實(shí)體瘤的療效。但是，這些NPs在被吸收后對(duì)于蛋白功能和隨之而來(lái)的生物效應(yīng)有何影響還知之甚少。

本文的主角依然是NDs，與之前不同的是這次沒(méi)有其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，單獨(dú)探究NDs的藥理作用與機(jī)理。

2019年4月29日發(fā)表在Materials horizons上，IF：14.356，通訊作者：宋海云，單位：上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

Pull-down實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)譜法確定NDs靶點(diǎn)

A549細(xì)胞離心，用PBS充分洗滌后加入裂解液 ，蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑等，再將澄清的上清液與ND在4℃下在搖床上孵育4小時(shí)，ND與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)充分結(jié)合，ND-蛋白質(zhì)復(fù)合物用washing buffer洗滌三次，ND表面結(jié)合的蛋白質(zhì)再用5%甲酸洗脫，胰蛋白酶消化過(guò)夜。再通過(guò)C-18色譜柱純化，并在Lineal Trap Quadropole離子阱質(zhì)譜儀上分析。

待鑒定的蛋白分為以下幾類：跨膜受體、細(xì)胞骨架、伴侶分子、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子。（圖1）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TβRⅡ是ND表面富集最多的蛋白，質(zhì)譜檢測(cè)到14種TβRII獨(dú)特肽，覆蓋其26.3％的完整蛋白序列。而TβRⅠ的豐度較低。TβRⅠ與TβRⅡ都是TGFβ信號(hào)通路的主要成分，這些發(fā)現(xiàn)暗示ND和TGFβ介導(dǎo)的生物學(xué)功能之間存在聯(lián)系。（圖2a）類似的結(jié)果也在下拉實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)。NDs與TβRⅡ相互作用，而NDs與TβRⅠ的相互作用超過(guò)儀器檢測(cè)的極限。（圖2a）因此，NDs可能通過(guò)TβRⅡ和TβRⅠ之間的動(dòng)態(tài)二聚作用間接地與TβRⅠ相互作用。

圖1

圖2

在與TGFβ配體結(jié)合后，TβRⅠ和TβRⅡ會(huì)經(jīng)歷胞吞作用，并隨后以稱為回收內(nèi)體的早期內(nèi)體的形式進(jìn)行回收。于是作者研究NDs與TβRⅠ和TβRⅡ相互作用是否會(huì)影響這些受體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。在對(duì)照組細(xì)胞中，只有低水平的TβRⅡ和TβRⅠ與溶酶體marker Lamp1共定位，這表明該細(xì)胞器中發(fā)生了TGFβ受體的基礎(chǔ)周轉(zhuǎn)。NDs治療大大增加了溶酶體定位的TβRⅡ的水平。另外，NDs也能增強(qiáng)TβRⅠ的溶酶體定位。（圖2c,d）這些結(jié)果表明對(duì)NDs的吸附阻止了TGFβ受體向再循環(huán)內(nèi)體的分選。盡管TβRI可能不直接結(jié)合ND，但其與TβRII二聚的能力使其對(duì)細(xì)胞對(duì)ND的吸收敏感。作者進(jìn)一步研究NDs攝取對(duì)A549細(xì)胞中這些受體蛋白質(zhì)水平的影響。作為對(duì)照，用NDs溫育不影響TGFβ信號(hào)成分Smad2和Smad3或跨膜受體Lrp6的細(xì)胞水平。相反，它很大程度上消除了TβRII和TβRI的水平。（圖2e）

圖3

作者繼續(xù)探究NDs介導(dǎo)的受體降解對(duì)TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的生物學(xué)影響，TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NDs能夠抑制癌細(xì)胞的遷移。（圖3a-c）與劃痕結(jié)果一致，transwell結(jié)果也顯示NDs能夠抑制TGFβ誘導(dǎo)的侵襲。（圖3d-f）

接下來(lái)，為了更好的模擬臨床上腫瘤的3D特征，作者開(kāi)展了腫瘤類器官實(shí)驗(yàn)，在3維培養(yǎng)基中驗(yàn)證NDs對(duì)A549細(xì)胞衍生的腫瘤類器官的影響。在TGFβ配體存在的情況下，球形腫瘤類器官的形狀變得不規(guī)則延伸。但是，NDs可以抑制TGFβ誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞延伸，并且逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的改變。（圖4a-c）在證明了NDs對(duì)體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞和腫瘤類器官轉(zhuǎn)移的影響后，作者接下來(lái)動(dòng)物體內(nèi)繼續(xù)探索。（圖4d）微靜脈注射A549細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)移瘤模型，在對(duì)照組小鼠的肺和肝中形成許多轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，微靜脈給予NDs（每三天一次，每只小鼠80μg）時(shí)間窗為18天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大大減少這些器官中轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量。（圖4，f）并且，HE染色結(jié)果也顯示密集增殖的癌細(xì)胞嚴(yán)重破壞肺和肝的原始結(jié)構(gòu)，而NDs可以大大減輕這些組織損傷。（圖4e,f）這些結(jié)果證實(shí)了注射NDs可以抑制腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖4

最后，作者檢查NDs對(duì)肺和肝轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)展的影響。TGFβ信號(hào)通路的激活可以影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM的數(shù)量并且提高M(jìn)2/M1的比例。而阻斷TGFβ信號(hào)通路可以促進(jìn)M1-TAM極化。作者利用熒光激活細(xì)胞分選分析來(lái)測(cè)量腫瘤組織中TAM和M2-TAM的水平。（圖5a）CD11b和F4/80是TAM的細(xì)胞表面marker蛋白，CD206則是M2-TAM的marker蛋白。流式細(xì)胞儀分析表明，NDs處理顯著降低浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中TAM的百分比，并顯著降低了總TAM中M2-TAM巨噬細(xì)胞的比例。（圖5a-c）并且，通過(guò)免疫組織熒光染色檢測(cè)腫瘤組織切片中浸潤(rùn)的TAM和M2-TAM的水平時(shí)，也觀察到了相似的結(jié)果。（圖5d）

圖5

總結(jié)

這篇文章的亮點(diǎn)有兩個(gè)，其一在于作者將目光聚集在“不起眼”的藥物載體NDs上，闡明NDs進(jìn)入機(jī)體后對(duì)于腫瘤細(xì)胞的作用。其二在于藥物作用靶點(diǎn)的尋找，通過(guò)蛋白質(zhì)譜和下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)NDs表面結(jié)合的蛋白為T(mén)βRⅡ，在確定了靶點(diǎn)之后再進(jìn)一步探究給予NDs后TGFβ信號(hào)通路下游的變化以及腫瘤細(xì)胞特性的改變。這篇文章也為尋找藥物靶點(diǎn)提供了新的思路。